在間接ELISA實驗中，一抗和二抗的最佳稀釋比例并沒有固定標準，而是需要根據抗體的特異性、效價、來源（如單克隆或多克隆）、實驗目的（定性或定量）以及樣本類型通過預實驗確定。以下內容將提供基于常規實驗場景的參考范圍、核心影響因素及優化方法，幫助快速確定合適的稀釋比例。
一、一抗稀釋比例的常規范圍
一般推薦的一抗起始稀釋比例為1:100至1:1000，具體需結合抗體說明書進行調整。對于高豐度抗原（如血清IgG），可考慮使用1:200至1:500，而對于低豐度抗原（如細胞因子），則建議稀釋比例在1:50至1:100之間。
優化方法包括使用棋盤滴定法，通過梯度稀釋（例如1:50、1:100、1:200等）進行測試，選擇強陽性樣本的OD值接近0.8，并確保陰性樣本的OD值小于0.1。建議在預實驗中，如果說明書推薦的稀釋比例為1:200，測試系列稀釋范圍從1:50到1:500均是值得嘗試的策略。
二、二抗稀釋比例的常規范圍
對于酶標記的二抗，常見的稀釋比例一般為1:5000至1:10000，而熒光標記的二抗通常在1:200至1:2000之間。需要強調的是，二抗的標記物類型（如HRP或AP）以及檢測系統的靈敏度對結果有重要影響。
在優化過程中，可以通過間接法測定抗體時，利用酶標二抗的工作濃度繪制A值曲線（如1:1600）來確認。要避免過度稀釋帶來的信號不足，或稀釋不足引起的高背景問題。
三、樣本稀釋注意事項
對于高濃度樣本（例如血清），建議進行預稀釋（1:100–1:500），以避免出現鉤狀效應。采用梯度稀釋法（如先稀釋10倍再20倍）可以減少誤差。
在抗體選擇方面，一抗需與樣本的種屬匹配（如大鼠樣本應避免使用鼠源抗體），而二抗必須與一抗的宿主種屬相匹配（例如，抗兔的二抗用于兔源一抗）。
四、快速優化最佳稀釋比例的方法
建議通過預實驗以“棋盤式預實驗”同時驗證一抗和二抗的組合稀釋比例，從而高效地篩選出最佳條件，步驟如下：
- 固定抗原的包被濃度，按照之前確定的最佳濃度包被96孔板（如5μg/mL），封閉后備用。
- 設置一抗稀釋梯度：在橫排設置3–4個梯度（如1:2000、1:5000、1:8000、1:10000），每孔加入100μL稀釋后的一抗，室溫孵育1–2小時，然后洗板。
- 設置二抗稀釋梯度：在豎排設置3–4個梯度（如1:3000、1:5000、1:8000），每孔加入100μL稀釋后的二抗，同樣在室溫下孵育1–2小時，之后洗板。
- 顯色與讀數：添加TMB底物顯色15–30分鐘后終止，并測量450nm的吸光度（OD值）。
- 篩選標準為：選擇“陽性孔OD值≥0.10（信號充足）、陰性孔OD值≤0.02（背景低）、陽性/陰性OD比值（P/N）≥5”的一抗與二抗組合，即為最佳稀釋比例。
在此過程中，您可以結合新葡萄8883官網AMG的相關產品，以確保獲得最佳實驗結果。強烈建議通過預實驗來確定最佳稀釋比例，并參考試劑盒的標準曲線范圍（如OD值12附近）進行調節。
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